ATAC-seq

A、定义

ATAC-seq 是一种用于检测全基因组染色质开放状态的高通量测序技术。
其核心原理是利用超活性 Tn5 转座酶 preferentially 插入开放染色质区域，从而实现：

·       染色质可及性图谱绘制

·       启动子和增强子定位

·       转录因子结合位点推断

·       调控元件活性分析

ATAC-seq 相比 DNase-seq 和 FAIRE-seq 具有：

·       操作简单

·       样本需求量低

·       分辨率高

·       背景低

·       实验周期短

广泛应用于表观遗传学、发育生物学、肿瘤研究及免疫调控研究。

B、实验方案

1️ 技术原理

1.       细胞裂解获得细胞核

2.       加入 Tn5 转座酶

3.       转座酶在开放染色质区域插入测序接头

4.       PCR 扩增建库

5.       高通量测序

2️ 实验类型

·       常规 Bulk ATAC-seq

·       低细胞量 ATAC-seq

·       单细胞 ATAC-seq（scATAC-seq）

·       Multiome（scRNA + scATAC 联合）

 

3️ 样本类型

·       细胞系

·       原代细胞

·       PBMC

·       新鲜组织

·       冷冻组织（需优化核提取）

 

4️ 推荐细胞量

实验类型

推荐细胞量

常规 ATAC-seq

50,000–100,000 细胞

低细胞量 ATAC-seq

5,000–20,000 细胞

单细胞 ATAC-seq

≥5,000 细胞

 

C、测序策略

1️ 建库策略

·       双端测序（PE50 或 PE75 推荐）

·       文库片段大小分布：~50–1000 bp（呈核小体周期性）

2️ 推荐测序深度

实验类型

推荐数据量

常规 ATAC-seq

30–50M reads

复杂样本

50–80M reads

单细胞 ATAC-seq

≥25,000 reads/细胞

 

3️ 数据分析流程

·       原始数据质控（FastQC）

·       比对（Bowtie2 / BWA）

·       去重复

·       Peak calling（MACS2）

·       TSS 富集分析

·       motif 富集分析

·       差异开放区域分析

·       通路富集分析

4️ 关键质控指标

·       TSS enrichment score ≥ 6–8

·       FRiP（Fraction of Reads in Peaks） ≥ 0.2

·       片段大小周期性明显

·       低线粒体 reads 比例

 

D、应用方案

🔬 染色质开放图谱构建

·       全基因组开放区域鉴定

·       启动子/增强子定位

🧬 转录调控研究

·       转录因子结合位点推断

·       motif 富集分析

·       调控网络构建

🩺 疾病机制研究

·       肿瘤表观遗传异常

·       免疫激活状态

·       发育异常机制

🌍 单细胞与多组学联合

·       scATAC + scRNA 联合分析

·       构建细胞类型特异调控网络

·       轨迹调控分析

E、送样建议

1️ 细胞样本

·       活率 ≥ 85%

·       无明显团聚

·       新鲜优先

·       建议提供对照组

2️ 组织样本

·       新鲜组织优先

·       冷冻组织需保证 RNA/DNA 完整性

·       提供组织来源信息

3️ 样本运输

·       干冰运输（冷冻样本）

·       4℃短时运输（新鲜样本）

·       避免反复冻融

F、常见 FAQ（科研导向版）

Q1：ATAC-seq 与 ChIP-seq 有何区别？

·       ATAC-seq 检测开放染色质

·       ChIP-seq 检测特定蛋白结合位点

ATAC-seq 更适合：

·       全局调控分析

·       无已知抗体情况下的研究

Q2：ATAC-seq 是否可以替代 ChIP-seq？

不能完全替代。

ATAC-seq 推断转录因子结合位点，但不能直接证明结合。

Q3：样本量少是否可以做 ATAC-seq？

可以，ATAC-seq 对细胞需求量低，但：

·       低输入样本需优化 PCR 周期

·       易产生重复 reads

Q4：生物学重复如何设计？

建议：

·       ≥ 2–3 个生物学重复

·       统一处理流程

·       同批次建库

Q5：单细胞 ATAC-seq 是否成熟？

目前技术成熟，适用于：

·       异质性组织

·       发育轨迹研究

·       免疫细胞亚群调控研究

但数据分析复杂度较高。

G、经典文献

1.       Buenrostro, J. D. et al. (2013). Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling. Nature Methods.

2.       Buenrostro, J. D. et al. (2015). Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature.

3.       Corces, M. R. et al. (2017). An improved ATAC-seq protocol reduces background. Nature Methods.

4.       Stuart, T. et al. (2021). Single-cell chromatin state analysis with Signac. Nature Methods.

5.       Satpathy, A. T. et al. (2019). Massively parallel single-cell chromatin landscapes. Nature Biotechnology.