WGBS全基因组甲基化测序

A、定义

WGBS（全基因组亚硫酸氢盐测序）是一种在全基因组范围内以单碱基分辨率检测 DNA 甲基化水平的高通量测序技术。

其核心原理是：

·       亚硫酸氢盐处理将未甲基化的 C 转化为 U（测序时表现为 T）

·       甲基化的 C 保持不变

·       通过测序比对实现 CpG、CHG、CHH 位点的甲基化状态解析

WGBS 是目前分辨率最高、覆盖范围最完整的 DNA 甲基化检测技术，被广泛应用于：

·       表观遗传调控研究

·       肿瘤甲基化异常研究

·       发育与分化研究

·       环境与表观调控研究

B、实验方案

1️ 技术原理

1.       提取高质量基因组 DNA

2.       DNA 片段化

3.       接头连接

4.       亚硫酸氢盐转化

5.       PCR 扩增建库

6.       高通量测序

2️ 实验类型

·       全基因组 WGBS（覆盖所有 CpG 位点）

·       低输入 WGBS

·       单细胞 WGBS

·       RRBS（简化版富集 CpG 区域）

3️ 样本类型

·       组织样本

·       细胞样本

·       血液样本

·       FFPE（需优化处理）

4️ DNA 需求量

类型

推荐 DNA 起始量

常规 WGBS

≥1 μg

低输入 WGBS

10–100 ng

单细胞 WGBS

单细胞水平

 

C、测序策略

1️ 建库与测序模式

·       双端测序（PE150 推荐）

·       高覆盖深度以确保甲基化准确性

2️ 推荐测序深度

研究目的

推荐测序量

全基因组覆盖

≥30× 覆盖度

高精度 DMR 分析

≥40×

单细胞 WGBS

≥1–5M reads/细胞

 

3️ 数据分析流程

·       原始数据质控（FastQC）

·       亚硫酸氢盐比对（Bismark / BS-Seeker）

·       甲基化位点识别

·       DMR（差异甲基化区域）分析

·       基因注释与功能富集

·       甲基化-表达联合分析

4️ 关键质控指标

·       转化效率 ≥99%

·       重复率控制

·       覆盖均匀性

·       CpG 覆盖比例

D、应用方案

🔬 表观遗传调控研究

·       启动子甲基化分析

·       增强子甲基化动态

·       印记基因研究

🧬 肿瘤研究

·       癌症特异性甲基化标记

·       肿瘤分型

·       预后标志物筛选

🧪 发育与分化研究

·       胚胎发育甲基化重塑

·       细胞命运决定

·       组织特异甲基化模式

🌍 多组学整合

·       WGBS + RNA-seq

·       WGBS + ATAC-seq

·       WGBS + ChIP-seq

E、送样建议

1️ DNA 质量要求

·       OD260/280 = 1.8–2.0

·       无明显降解

·       无 RNA 污染

2️ 样本保存

·       -80℃ 保存

·       避免反复冻融

·       提供样本来源信息

3️ 特殊样本

·       FFPE 建议提供切片信息

·       低输入样本需提前沟通

F、常见 FAQ（科研导向版）

Q1：WGBS 与 RRBS 有何区别？

项目

WGBS

RRBS

覆盖范围

全基因组

CpG 富集区域

成本

高

较低

分辨率

全覆盖

局部覆盖

 

Q2：WGBS 是否检测非 CpG 甲基化？

是的，可以检测 CpG、CHG、CHH 位点甲基化。

Q3：样本量不足是否可以做 WGBS？

可以采用低输入建库策略，但：

·       数据重复率可能升高

·       需增加测序深度

Q4：是否必须做生物学重复？

建议：

·       ≥3 个生物学重复

·       同批次建库

Q5：亚硫酸氢盐处理是否损伤 DNA？

是的，处理过程会导致 DNA 降解，因此：

·       要求高质量 DNA

·       控制建库周期

·       优化 PCR 扩增

G、经典文献

1.       Lister, R. et al. (2009). Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature.

2.       Cokus, S. J. et al. (2008). Shotgun bisulfite sequencing of the Arabidopsis genome. Nature.

3.       Gu, H. et al. (2011). Preparation of reduced representation bisulfite sequencing libraries. Nature Protocols.

4.       Smallwood, S. A. et al. (2014). Single-cell genome-wide bisulfite sequencing. Nature Methods.

5.       Bock, C. et al. (2010). Quantitative comparison of genome-wide DNA methylation mapping technologies. Nature Biotechnology.