二代扩增子测序

A、定义

二代扩增子测序（Amplicon Sequencing）是一种基于特定引物对目标基因区域进行 PCR 扩增后，通过高通量测序平台进行序列分析的技术。

常见应用包括：

·       16S rRNA 基因测序（细菌群落分析）

·       ITS 测序（真菌群落分析）

·       18S rRNA 测序（真核微生物）

·       特定功能基因扩增（如抗性基因、代谢相关基因）

·       肿瘤热点突变区域检测

与宏基因组测序相比，扩增子测序具有：

·       成本较低

·       数据分析相对简洁

·       适合大规模样本队列研究

·       对低丰度物种具有一定灵敏度

 

B、实验方案

1️ 技术原理

1.       提取样本总 DNA

2.       使用特异性引物扩增目标区域

3.       纯化 PCR 产物

4.       构建测序文库

5.       上机测序

6.       生物信息分析

 

2️ 常见扩增区域

类型	常用区域
细菌	16S rRNA V3–V4 / V4 区域
真菌	ITS1 / ITS2 区域
真核微生物	18S rRNA
抗性基因	ARG 特定区域
肿瘤突变	Hotspot panel

 

3️ 样本类型

·       粪便样本

·       口腔/鼻咽拭子

·       皮肤拭子

·       土壤

·       水体

·       动植物组织

 

C、测序策略

1️ 建库与测序模式

·       双端测序（PE250 或 PE300 推荐）

·       适合拼接完整扩增片段

2️ 推荐测序深度

研究目的	推荐 reads 数
基础菌群结构分析	≥30,000–50,000 reads/样本
高复杂环境样本	≥100,000 reads/样本
群落差异分析	≥50,000 reads/样本

 

3️ 数据分析流程

·       原始数据质控（Fastp）

·       双端拼接（FLASH）

·       去噪与特征表构建（DADA2）

·       OTU 或 ASV 分析

·       物种注释（SILVA / UNITE 数据库）

·       α 多样性分析（Shannon / Simpson）

·       β 多样性分析（PCoA / NMDS）

·       差异菌群分析（LEfSe）

 

4️ 关键质控指标

·       Q30 ≥ 85%

·       有效 reads 数量

·       扩增特异性

·       污染控制

D、应用方案

🔬 微生态群落结构研究

·       肠道菌群结构分析

·       菌群多样性比较

·       干预前后变化研究

 

🦠 感染与炎症研究

·       病原微生物群落变化

·       抗生素使用影响

·       免疫状态相关菌群分析

 

🌍 环境微生物研究

·       土壤微生物多样性

·       水体生态系统监测

·       农业生态微生物

 

🧬 功能基因分析

·       抗性基因分布

·       代谢功能基因

·       特定通路相关基因

 

E、送样建议

 

1️ 粪便样本

·       新鲜采集

·       -80℃ 保存

·       建议 ≥200 mg

2️ 拭子样本

·       无菌操作

·       使用 DNA 保存液

·       低温运输

3️ 环境样本

·       记录采样信息

·       避免交叉污染

·       冷链运输

4️ DNA 质量要求

·       OD260/280 = 1.8–2.0

·       无明显降解

·       无 PCR 抑制物

 

F、常见 FAQ（科研导向版）

 

Q1：扩增子测序与宏基因组测序的区别？

项目	扩增子测序	宏基因组测序
成本	较低	较高
分辨率	属/部分物种	物种/菌株
功能分析	预测	实测
病毒检测	不适合	可检测

 

Q2：是否存在 PCR 偏倚？

是的。不同引物对不同物种扩增效率不同，因此：

·       引物选择非常关键

·       建议统一批次扩增

·       设置阴阳性对照

 

Q3：是否必须做生物学重复？

建议：

·       每组 ≥3 个生物学重复

·       统一采样时间与条件

 

Q4：能否检测低丰度物种？

可以，但：

·       需足够测序深度

·       PCR 偏倚可能影响结果

 

Q5：扩增子数据是否可以直接用于功能分析？

通常为功能预测（如 PICRUSt），不等同于真实功能检测。

 

G、经典文献

1.       Caporaso, J. G. et al. (2011). Global patterns of 16S rRNA diversity. PNAS.

2.       Callahan, B. J. et al. (2016). DADA2: High-resolution sample inference. Nature Methods.

3.       Bokulich, N. A. et al. (2018). Optimizing taxonomic classification of marker-gene sequences. mSystems.

4.       Nilsson, R. H. et al. (2019). The UNITE database for molecular identification of fungi. Nucleic Acids Research.

5.       Quast, C. et al. (2013). The SILVA ribosomal RNA gene database project. Nucleic Acids Research.